题目： 菌寄生真菌纤细齿梗孢蛋白酶基因的克隆与表达
姓名： ** 学号： ****
年级： *** 专业： 植物保护
指导教师：姓名 *** 职称 教授
学科 植物病理
山东农业大学教务处
二○○ 年 五 月 十八 日
一、选题依据(拟开展研究项目的研究目的、意义)
菌寄生(mycoparasitism)是发生在菌寄生真菌与寄主真菌之间的一种寄生方式，是自然界普遍存在的一种真菌与真菌之间的相互作用。一直以来，生物间相互作用及信号传导的分子机制，是当今生命科学研究的热门。利用菌寄生真菌与寄主真菌作为研究的模式系统来揭示生物相互之间的相互作用机制有重要理论和实践意义。李多川(li,1996)先生发现纤细齿梗孢(olpitrichum tenellum)和串珠镰刀菌(fusarium moniliforme)的菌寄生关系以来，我们实验室试图通过研究纤细齿梗孢和串珠镰刀菌，来建立菌寄生真菌与寄主真菌相互作用机制研究的模式系统，从而揭示菌寄生真菌与寄主真菌之间相互作用的分子机制。纤细齿梗孢(olpitrichum tenellum)是串珠镰刀菌的一种重寄生真菌，该菌是一种接触性活体重寄生菌，离体试验发现其分生孢子只有在串珠镰刀菌细胞壁提取物刺激下才能萌发。这说明两者之间的重寄生关系是建立在二者识别与互作的分子机制上的(li,XX)。在纤细齿梗孢和串珠镰刀菌相互作用过程中，几丁质酶、蛋白酶等细胞壁裂解酶可能起到重要作用。其中，蛋白酶在木霉属菌寄生真菌中的功能已经得到初步证明，而纤细齿梗孢的蛋白酶的研究还未见报道。因此，克隆纤细齿梗孢蛋白酶编码基因对于从分子水平上研究重寄生真菌和寄主识别和互作机制有着重要的意义。
二、文献综述内容(在充分收集研究主题相关资料的基础上，分析国内外研究现状，提出问题，找到研究主题的切入点，附主要参考文献)
纤细齿梗孢(olpitrichum tenellum)是李多川教授分离得到的一种活体营养接触型菌寄生真菌[1~3]，其寄主包括fusarium moniliformealternaria alternata等。近年来，我们实验室一直在努力以其为基础研究菌寄生真菌与寄主真菌之间的相互作用的分子机制。经过多年的研究，人们渐渐认识到真菌细胞壁蛋白在细胞与外界的相互作用过程中扮演着重要的角色。细胞壁蛋白研究已经成为生物间相互识别机制研究的热点。鉴于以上原因，我们实验室成功分离纯化了纤细齿梗孢的寄主之一alternaria alternata菌丝细胞壁上的一种特异性糖蛋白——凝集素，并初步证明其在rnaria和llum孢子吸附过程中起到识别因子的作用[4]。近年来，菌寄生真菌细胞壁裂解蛋白酶在菌寄生过程中的作用被人们逐渐重视起来。克隆和表达菌寄生真菌的蛋白酶编码基因变得很有意义。本研究试图以菌寄生真菌纤细齿梗孢(olpitrichumtenellum)作为研究材料克隆了其蛋白酶基因。根据氨基酸的保守序列设计兼并引物，然后采用rt-pcr和race是一个较为快速、简单和高效的方法。本实验根据同源保守序列设计兼并引物，通过rt-pcr及race-pcr的方法，克隆了llum蛋白酶的编码基因的全长cdna序列，并对该基因进行了序列分析，为后续试验打下了基础。
由于olpitrichum tenellum在离开寄主的人工培养基中很难生长，纯化其蛋白酶变得非常困难。因此，我们需要使用外源蛋白表达系统得到蛋白，进一步研究其性质，从而搞清楚其在重寄生过程中的作用。在过去的几十年间，随着dna重组技术的不断发展，通过构建遗传工程菌株，人们可以较容易地使各种各样的天然酶的基因在微生物系统中高效表达，从而在很大程度上摆脱对天然酶源的依赖。
基因工程的表达系统有原核表达系统和真核表达系统两大类。在原核表达系统中，大肠杆菌表达系统是目前了解最深入，实际应用最为广泛的表达系统。与其他表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高、培养周期短、抗污染能力强等特点。在基因表达技术中占有重要的地位，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具[5]。
pichia pastoris基因表达系统经过十几年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因在宿主基因组中稳定整合，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子aox1，已高效表达了hbsag、tnf、egf、破伤风毒素c片段、基因工程抗体等多种外源基因[6]，证实该系统是高效、实用、简便，能提高表达量并保持产物生物学活性的外源基因表达系统。oris表达系统在生物工程领域将发挥越来越重要的作用，促进更多外源基因在该系统的高效表达，提供更为广泛的基因工程产品[7]。
我们已经分离到llum蛋白酶的编码基因，本研究中将该基因的去掉信号肽序列的正确阅读框融合于原核表达载体pet-22b(+)和毕赤酵母表达载体ppic9k上，分别转化 bl21及pichia pastoris gs115，以期在这些菌株中有效表达该基因的编码产物，从而为以后功能研究打下基础。
1 李多川.1998.菌寄生真菌分子生物学研究进展.吉林农业大学学
报,20：37~65.
2 21.李多川.1998.菌寄生真菌分子生物学研究进展.微生物学通报，25：
345~347.
3 .李多川，沈崇尧.1997.菌寄生菌物与寄主菌物相互作用的研究进展.
西北农业学报，6：94~98.
4 张成省，李多川，孔凡玉rnaria alternata菌丝细胞壁凝集素
的纯化与特性研究.植物病理学报，35(2)：141~147.
5 .11.何诚，朱运松.1998.甲醇营养型酵母表达系统的研究进展.生物工程
进展,18:7~11.
6 彭毅，杨希才，康良仪.影响甲醇酵母外源蛋白表达的因素.生
物技术通报，4:33~36.
7 韩雪清，刘湘涛，尹双.毕赤酵母表达系统.微生物学杂志，
3:35~40.
三、研究方案(主要研究内容、目标，研究方法、进度)
一、研究内容：
本课题选择纤细齿梗孢(olpitrichum tenellum)做为研究对象，通过rt-pcr及race技术分离克隆了其丝氨酸蛋白酶基因，并进行原核及真核表达，并对其的性质进行了研究，为进一步的研究工作打下基础。
二、研究的目标：
克隆了纤细齿梗孢(olpitrichum tenellum)的丝氨酸蛋白酶基因，进行原核及真核表达，并对其的性质进行了研究。
三、研究方法
将纤细齿梗孢(olpitrichum tenellum)接种到lb培养基上，培养14个小时后，收集菌丝，然后采用总trizol法提取rna。再从genbank数据库中搜索到大量的蛋白酶氨基酸序列，并根据同源性进行分类，分别设计兼并引物。再通过rt-pcr、3’-race、5’-race获得全长cdna、dna克隆，并将其连接到载体上，然后采用电击法将将重组质粒转入到全长cdna、dna克隆中，通过透析纯化蛋白酶，最后研究其特性。
四、研究进度：
XX年5月23日~XX年5月29日 整理收集资料，并跟着研究生学习基本实验技术。
XX年5月30日~XX年6月18日 提取rna，设计引物、全长cdna、dna克隆 。
XX年6月19日~XX年7月15日 转化大肠杆菌、毕赤酵母表达，获得纯纯产物，并研究其特性。
XX年3月~XX年6月 对实验结果不理想的实验重做，整理实验数据，完成毕业论文，并准备毕业答辩。
五、技术路线：
收集菌丝
总rna提取
同源序列 设计引物
特性研究
rt-pcr、
3’-race、5’-race
纯化表达产物
全长cdna、dna克隆 转化大肠杆菌、毕赤酵母
四、进程计划(各研究环节的时间安排、实施进度、完成程度)
XX年5月23日~XX年5月29日 整理收集资料，并跟着研究生学习基本实验技术。完成实验的1%。
XX年5月30日~XX年6月18日 提取rna，设计引物、全长cdna、dna克隆。完成实验的50%。
XX年6月19日~XX年7月15日 转化大肠杆菌、毕赤酵母表达，获得纯纯产物，并研究其特性。完成实验的95%。
XX年3月~XX年6月 对实验结果不理想的实验重做，整理实验数据，完成毕业论文，并准备毕业答辩。完成100%。
五、导师对文献综述的评语
签字：
200 年 月 日
六、 专业意见
专业主任签字：
200 年 月 日
七、学院意见
学院(章)： 负责人签字：
200 年 月 日